Thèse Preuve de Concept In Vitro d'Une Nanoplateforme Active Ciblant le Récepteur Mc1r une Alternative Thérapeutique en Photothérapie Dynamique pour le Mélanome de Dubreuilh. H/F - Doctorat.Gouv.Fr

Établissement : Université Clermont Auvergne École doctorale : Sciences de la Vie, Santé, Agronomie, Environnement Laboratoire de recherche : Imagerie Moléculaire et Stratégies Théranostiques Direction de la thèse : MERCEDES QUINTANA ORCID 000000022069907X Début de la thèse : 2026-10-01 Date limite de candidature : 2026-06-12T23:59:59 Quel est l'intérêt de la Photothérapie dynamique (PDT)pour le traitement du mélanome de Dubreuiln ?
La PDT est un traitement très peu invasif fondé sur l'activation d'un photosensibilisateur (PS) sous illumination en présence d'oxygène. Sous une illumination appropriée, le PS non toxique est activé, et ainsi, il absorbe et de transférer des électrons aux molécules d'oxygène trouvées in situ. Une cascade de production des espèces réactives de l'oxygène (ROS) cytotoxiques est déclenché. Cela induit ensuite des dommages irréversibles aux tissus, provoquant la mort cellulaire. Le mélanome de Dubreuilh, appartenant à la famille de mélanomes cutanés (4 à 15 % de tous les mélanomes) se caractérise par la prolifération anarchique des mélanocytes à la jonction dermo-épidermique. Cette croissance peut durer de nombreuses années, pendant laquelle la lésion s'étend latéralement avec des extensions superficielles très importantes. Cela explique pourquoi il possède un taux de survie à 5 ans élevés (97,2 %). Les zones chroniquement exposées à des radiations UV sont les plus touchées, comme le visage, la tête, le coup. De ce fait, cette pathologie pose régulièrement des problèmes thérapeutiques, que ce soit pour des raisons d'opérabilité, d'exérèse incomplète ou de récidive. Ainsi, la PDT, se présente comme une alternative de traitement à ce type de mélanome. Essentiellement, les éléments comme : l'accessibilité des lésions vis-à-vis de l'illumination et la possibilité d'optimisation des PS, en ajoutant des modifications pour le diriger spécifiquement vers les cellules tumorales, font de ce traitement par photothérapie dynamique une piste thérapeutique à fort potentiel.
L'objectif de la thèse : Dans ce projet de thèse, l'axe préclinique sera étudié afin d'établir la preuve de concept in vitro de l'efficacité d'une nouvelle nanoplateforme ciblant les cellules MC1R+ surexprimées dans des mélanomes pigmentés suite à un traitement par PDT
Déroulé de projet de thèse :
Trois axes essentiels seront développés :
1) Finaliser l'optimisation de la nanoplateforme active pour assurer une reconnaissance spécifique et une efficacité maximale du ciblage du récepteur MC1R. La nanoplateforme est constituée d'un ligand, vecteur peptidique NDP-MSH et un PS, la pyropheophorbide a, tous deux couplés de façon spécifique à une nanoparticule d'or de diamètre 50 nm. Le PS possède une longueur d'onde d'absorption égale à 670 nm, permettant d'être dans les conditions favorables concernant l'efficacité de l'illumination. La confirmation de la caractérisation sera réalisée par diffusion dynamique de la lumière (DLS), microscopie électronique à transmission (TEM), et par ICP-MS entre autres.
2) Evaluer l'efficacité thérapeutique in vitro de la nanoplateforme afin de valider son potentiel en photothérapie dynamique pour le traitement du mélanome de Dubreuilh. L'influence de paramètres de traitement, comme le temps d'illumination, la puissance d'illumination et la concentration des nanoplateformes seront étudiés sur des lignée B16F10 (MC1R+) et A375-MA1 (MC1R-)
Une première évaluation consistera en la réalisation des tests de viabilité cellulaire en utilisant le système d'imagerie cellulaire automatisé, Incucyte®.
3) Identifier les principaux mécanismes impliqués dans la réponse au traitement par PDT.
L'évaluation des mécanismes impliqués dans la mort cellulaire sera alors évaluée plus en détail. Pour se faire, des tests de stress oxydatif et de détection d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) seront réalisés après illumination par spectrofluorimétrie et par cytométrie en flux. Pour caractériser les mécanismes de mort cellulaires impliqués, des marqueurs d'apoptose, de nécrose ainsi que d'autophagie seront étudiés par Western Blot.
Ce projet, permettra d'acquérir de nouvelles connaissances et compétences en photothérapie dynamique, utilisant des nanoparticules en oncologie. Le projet bénéficie du soutien de la Ligue contre le cancer (2025-2027)
Le mélanome de Dubreuilh ou lentigo maligna (LM), est un sous-type de mélanome in situ constituant entre 5 à 10% des mélanomes cutanés. Le LM, concerne majoritairement des personnes de plus de 50 ans affectant principalement les zones chroniquement endommagées par l'exposition aux rayons UV, notamment le visage [1,2]. En termes d'évolution, il se caractérise par une période de croissance intraépithéliale longue expliquant le pronostic favorable avec un taux de survie à 5 ans proche de 100%1, 2. Cependant, le risque de progression du LM vers le derme est estimé à 50% [3].
La chirurgie est le traitement de choix pour le LM, avec des marges d'exérèses recommandées entre 5 à 10 mm [4-5]. En raison de la grande taille des lésions et de leur localisation, le traitement chirurgical est complexe avec un risque de morbidité fonctionnelle et/ou esthétique. Le traitement du LM est compliqué par la possibilité d'une extension infraclinique importante et des taux de récidives élevés après une chirurgie incomplète. La recherche de nouveaux traitements alternatifs peu invasifs est donc fondamentale afin de réduire le taux de récidive et améliorer la prise en charge des patients. C'est dans ce contexte, que s'inscrit le projet que nous avons initié au sein de l'UMR 1240 Inserm-IMOST, visant à évaluer l'intérêt de la PDT avec des AuNPs pour le traitement du mélanome de Dubreuilh in situ, inopérable ou récidivant.
La PDT consiste à utiliser un PS, de type porphyrines, chlorines ou phthalocyanines, inerte en absence de lumière mais cytotoxique par activation lumineuse. Régie par différents processus photophysiques et photochimiques, la PDT conduit à la production de radicaux libres et d'espèces oxygénées réactives (ROS), qui vont in fine induire la mort cellulaire soit de manière : i) directe, par apoptose, nécrose ou autophagie, soit : ii) indirecte, en provoquant des dommages vasculaires et immunitaires [6,7].
La PDT peut être utilisée seule ou en traitement complémentaire des thérapies conventionnelles [8]. Elle est préconisée dans le traitement de diverses maladies, notamment en oncodermatologie [9,10]. C'est une approche prometteuse pour la prise en charge du mélanome de Dubreilh. Une étude rétrospective publiée par Karam et al., montre que la PDT (60 J/cm2) avec le 5-aminolévulinate de méthyle a conduit à une guérison complète chez 12 patients sur 15 avec un LM du visage [11]. Plus récemment, la PDT assistée par un laser fractionné ablatif (90 J/cm2) a été utilisée afin d'augmenter l'absorption de d'une nanoémulsion d'acide 5-aminolévulinique (5-ALA), et a permis d'obtenir 70% de clairance histologique des lésions de LM traitées [12]. Cependant, l'absorption des rayonnements UV (forte entre 200-400 nm) et visible (déclinant de 400 à 800 nm) par les mélanines (eumélanine et pheomélanine) peut constituer une limite d'application de la PDT au mélanome. Des PS avec des longueurs d'onde d'absorption supérieures à 600 nm doivent donc être privilégiés pour garantir leur efficacité [13]. L'intérêt d'un ciblage actif des mélanocytes a été démontré par Bigliardi et al. [14] sur la lignée murine B16F10 et la lignée humaine pigmenté FM55. Cette équipe a utilisé le bleu de méthylène couplé de façon covalente à un ligand peptidique (NAP) dirigé vers le récepteur MC1R. Les lignées étaient ensuite irradiées à 660 nm, induisant une cytotoxicité spécifique des mélanocytes tumoraux et sains en préservant les kératinocytes. Récemment, le potentiel de phtalocyanines de Zn(II) comme PS contre les cellules B16F10 après irradiation à 660 nm et 3 J/cm2 a été mis en évidence [15].
L'utilisation des nanotechnologies pour la conception de PS de 3éme génération (formulation par encapsulation ou par liaison à des NPs) a permis d'améliorer les traitements par PDT en jouant sur la solubilité en phase aqueuse des PS, la photoactivité, ou bien encore le ciblage des cellules tumorales [17]. Les nanoparticules d'or (AuNPs) possèdent un rapport surface/volume élevé ainsi que des propriétés optiques dépendantes de leurs forme et taille, les rendant particulièrement intéressants en oncologie [18]. Ces NPs, biocompatibles et aisément fonctionnalisables en surface [19], possèdent également des propriétés plasmoniques utilisables en thérapie photothermique (PTT) [20].
Dans ce projet de thèse, l'axe préclinique sera étudié afin d'établir la preuve de concept in vitro de l'efficacité d'une nouvelle nanoplateforme ciblant les cellules MC1R+ surexprimées dans des mélanomes pigmentés suite à un traitement par PDT Les trois axes essentiels à développer sont présentés, avec la liste de méthodes (non exhaustive) :
1) Finaliser l'optimisation de la nanoplateforme active pour assurer une reconnaissance spécifique et une efficacité maximale du ciblage du récepteur MC1R.
- diffusion dynamique de la lumière (DLS)
- microscopie électronique à transmission (TEM)
- spectrométrie de masse désorption/ionisation laser assistée par matrice (MALDI-Tof-MS)
- spectrométrie de masse couplée à un plasma inductif (ICP-MS)

2) Evaluer l'efficacité thérapeutique in vitro de la nanoplateforme afin de valider son potentiel en photothérapie dynamique pour le traitement du mélanome de Dubreuilh. Ainsi que l'identication de principaux mécanismes impliqués dans la réponse au traitement par PDT.
- Culture cellulaire
- Système d'imagerie cellulaire automatisé, Incucyte®.
- Western Blot
- Cytométrie en flux
- Imagerie confocale
- Chromatographie liquide haute performance (HPLC)
- Spectrofluorimétrie
- Spectrométrie UV-visible

Chimie analytique et biochimie (préparation des échantillons, HPLC, Western Blot)
Culture cellulaire
Des connaissances pratiques en chimie organique, DLS, TEM, cyrtométrie en flux, et analyse des ROS seront un atout.
Des connaissances en culture cellulaire.

Savoir-être (ouverture d'esprit, travail collaboratif, adaptabilité, rigueur, esprit de synthèse) ;
Qualités professionnelles (rédactionnelles, flexibilité , sens critique, fiabilité, expertise en lien avec l'objet de recherche)